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微生物生长曲线分析仪菌密度的小知识:大小和形状的影响
  • 更新日期:2023-08-07      浏览次数:550
    • 上过微生物相关课程的同学,大抵都对菌液的OD600测量还有点印象:需要将样本稀释到合适的浓度,然后取样置于比色皿内,在分光光度计中测量600nm波长下的OD值。此外,也会有一个模糊的印象,当OD为1时1mL菌液中大概对应了多少数量的细胞。

      网络搜索1 OD与菌液浓度的对应关系时,发现给到的数据区间非常大,从1×10^7 ~2×10^9 cells/mL不等,但基本都会提到需要结合具体的菌种进行分析,培养物中细菌细胞的大小和形状会对OD600数值产生影响。


      细胞大小对OD600的影响

      Keiran Stevenson等研究人员制备了不同直径的微珠的分散溶液(图1),每种溶液的浓度和吸光度之间的标准曲线如图2A所示,在相同的OD600数值情况下,随着微珠的直径减小,对应的微珠浓度显著增加(图2B)。

      ▲图1 微珠的明场图像。A:15.7±1.4 μm;B:10.0±0.6 μm;C:3.00±0.07 μm;D:0.96±0.07 μm;E:0.51±0.01 μm。E中给出的刻度尺适用于A-E。

      ▲图2  球形微珠悬浮液的OD600测量。(A)对于给定的珠子直径,微珠悬浮液的浓度与OD600之间的关系。(B)微珠浓度与微珠直径之间的关系,同一条曲线上的点拥有相同的OD600值,随着箭头的方向,曲线从黑到红分别对应以下OD600值:0.05、0.1、0.5、1和10。每组5个重复,由于差异较小,部分数据重叠。


      细胞形状对OD600的影响

      Keiran Stevenson等研究人员还研究了真实的微生物形状和大小对OD600的影响。不同遗传背景的酵母、不同生长环境的大肠杆菌的显微镜图片如图3所示:酵母二倍体的体积大于酵母单倍体(图3B-D);大肠杆菌在亚致死浓度氨苄西林(ampicillin)的作用下被诱导成丝状(图3E);对数生长期的大肠杆菌繁殖活跃,个体较大(图3F);稳定期后期部分细胞死亡,个体较小(图3H);稳定期前期的大肠杆菌体积处于两者之间(图3G)。

      ▲图3  在显微镜下获得的不同微生物的代表性图像。(B)酵母CLN3Δ纯合二倍体突变体;(C)酵母二倍体;(D)酵母单倍体;(E)在亚致死浓度氨苄西林(ampicillin)存在下生长的大肠杆菌细胞,呈丝状;(F)对数生长期的大肠杆菌细胞;(G)稳定期早期的大肠杆菌细胞;(H)稳定期晚期的大肠杆菌细胞。B中给出的刻度尺适用于B-H。


      这些微生物培养液的浓度和吸光度之间的标准曲线如图4所示,与正常的大肠杆菌样品相比,经抗生素氨苄西林诱导的丝状大肠杆菌细胞的校准曲线变化较大。酵母(细胞尺寸4~6μm)的细胞大小变化对校准曲线的影响要比细菌(细胞尺寸0.7~1.5μm)的影响要小。

       ▲图4  微生物浓度与OD600之间的关系。酵母CLN3Δ纯合二倍体突变体(深灰)、酵母二倍体(浅灰)、酵母单倍体(紫色)、丝状大肠杆菌(绿色)、以及对数生长期(黑色)、稳定期早期(蓝色)和晚期(红色)的大肠杆菌。

      综上所示,微生物的形状和大小都会对OD600测量产生影响,因此当需要通过OD600来估算菌液浓度时,不同的微生物需要单独制作标准曲线。


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      参考文献

      Stevenson K ,  Mcvey A F ,  Clark I , et al. General calibration of microbial growth in microplate readers[J]. Scientific Reports, 2016, 6:38828.



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