超声波细胞粉碎机应用脂质体多肽疫苗的处方工艺优化及免疫效果评价

　　一、实验目的

　　多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。基于脂质的递送系统已被确立为诱导体液和细胞免疫反应的强大递送系统，目前应用最为广泛的是脂质体和脂质纳米粒(lipid nanoparticle, LNP)。脂质体可以包裹水溶性和脂溶性药物，增强抗原蛋白的稳定性，并通过储存效应促进疫苗成分的逐渐释放，更适合递送亲水性多肽分子，但仍存在稳定性较差，包封率较低的问题。本研究选择脂质体作为免疫递送系统构建多肽疫苗，设计构建了脂质体的处方工艺，并通过单因素实验对脂质体制备的处方工艺进行优化。

　　二、实验方法

　　1.超声功率的选择：

　　以优化后的膜材比制备脂质体，在保持其他因素不改变的情况下，考虑到超声功率过大会导致大量发热，依次改变超声功率(30、40、50、60 W)(仪器：超声波细胞粉碎机)，继续进行4组实验，分别测定各组脂质体粒径分布和多分散系数。

　　2.超声次数/时间的选择：

　　以优化后的膜材比、超声功率制备脂质体，在控制其他因素不改变的情况下，依次改变超声次数(30,40,50,60)，继续进行4组实验，分别测定各组脂质体粒径分布和多分散系数。

　　三、实验结果

　　1.超声功率的筛选结果：

　　由表1可知，当超声功率为30 W、平均粒径为162.2 nm、PDI为18.3%时，所制备的脂质体最好;当超声功率为60 W时，功率较大导致溶液温度明显升高，脂质体的粒径偏大，PDI为0.351,分散程度也明显变大，不适合作为制备条件。

　　2.超声次数的筛选结果：

　　由表2可知，当超声次数为40次时，所得脂质体物理性质较优。实验过程中发现，当超声次数为60次时，置于超声破碎机内的样品溶液温度较高，从表2结果也可以看出，过高的温度导致所制备的脂质体平均粒径和PDI升高，提示在脂质体制备过程中要考虑温度的影响。

　　表1 不同超声功率条件下制备脂质体的粒径分布

 

　　表2 不同超声次数条件下制备脂质体的粒径分布

　　四、讨论

　　脂质体的理化性质是决定脂质体发挥作用效果的重要影响因素，粒径及其分布是判断脂质体是否合格的重要指标。研究表明，纳米颗粒(<200 nm)更容易通过淋巴引流进入淋巴结，并促进抗原提呈细胞的吸收，使其更适合传递分子佐剂和抗原。单因素实验得到的较优的制备条件为：膜材比5∶1、超声功率30 W、超声次数40次、高压均质时间6 min，使脂质体的平均粒径从329.7 nm减小至132.0 nm，对此制备流程进行了验证，其结果与预期相符，且PDI均在30%以下，说明脂质体粒径分布比较均匀。